De prionziekte kan alleen definitief bevestigd worden via hersenbiopsie en autopsie. Verscheidene eiwitten in de liquor zijn markers voor neuronaal letsel en deze zijn bij prionziekte vaak verhoogd; de markers die het vaakst voor diagnostische doeleinden worden gebruikt zijn 14-3-3 en tau; deze hebben een hoge sensitiviteit, maar een wisselende specificiteit. Ook de RT-QuIC-test (real-time quaking induced conversion) is een diagnostische liquortest. Met deze test, die een extreem hoge specificiteit heeft, is het mogelijk minieme hoeveelheden ziekteveroorzakende prioneiwitten te amplificeren. MRI-onderzoek met DWI (diffusion-weighted imaging) wordt tegenwoordig beschouwd als de meest sensitieve diagnostische test. Daarbij worden meestal multifocale grijzestofhyperintensiteiten gevonden in subcorticale en/of corticale gebieden. Bij sommige mensen vertoont het eeg periodieke scherpe, vaak trifasische en synchrone ontladingen van 0,5–2 Hz, op enig moment tijdens het beloop van de stoornis. Het is belangrijk om hierbij op te merken dat er per type prionziekte (zoals sporadische CJD, familiaire CJD en de variantvorm van CJD) verschillende diagnostische markers zijn.
